胶体金技术先锋热线：021-51098851

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        派坤生物通过国外成熟项目的直接引进和吸收，结合原有天津大学基因工程中试基地的整体技术优势，不断开发出适合国内POCT市场实际需要的胶体金系列产品。派坤生物公司宗旨是：联合国内体外诊断试剂企业，共同推进 体外诊断行业的发展，促进国内POCT快检行业的技术升级。

　

        派坤生物长期与美国、加拿大两国多家知名的体外诊断技术( IVDT)实验室保持技术互助关系。依托两个MRC的强大技术力量及其众多院士专家的顾问支持，公司已构建起胶体金免疫层析、干化学、电化学库仑阵列-HPLC、基因工程、多肽固相合成、抗原提取及合成、单克隆抗体、多克隆抗体、蛋白质芯片等核心技术平台。

        目前派坤生物CRO服务所涉及的体外诊断技术包括胶体金免疫层析、干化学、酶联免疫、免疫荧光与多聚酶链扩增、生物传感器、生物芯片等种类。包含疾病诊断、动物检疫、食品安全监测等多个系列逾二十几个种类的产品，产品的质量已达到国际市场上销售的同类产品的质量水平。 派坤生物以合作开发联盟（CRO）的方式与国内外众多诊断试剂公司共同成长，这里详细介绍下牛奶三聚氰胺胶体金免疫层析试纸以及牛奶掺假试纸联检方法的建立： 

　

R 项目名称 - 三聚氰胺检测试剂盒（胶体金法）         单位名称 - 天津大学-派坤生物联合实验室（点击在线参观）.         单位地址 - 天津大学北洋科学楼419室.         联系电话 - 021-28208234 高老师.         电子邮件 -  gch@3i.com.cn                  R 欢迎三聚氰胺国内外科研机构及专业销售公司与我们洽谈合作.         R 合作方式：OEM委托生产、半成品供应；三聚氰胺抗体来料加工 。

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 一、   三聚氰胺胶体金免疫层析试纸以及牛奶掺假试纸联检项目

　

1.1  目的意义：

　

        鲜奶和奶制品质量检测是目前乳制品企业面临的突出问题,一是检测设备不足。二是检测技术单一,检测成本较高,检测速度慢。

　

        目前国内有关方面正在研发奶制品中蛋白质和三聚氰胺含量的快速检验方法和仪器设备,主要有三类:即不用仪器设备的检测法(如干化学试纸条)、ELISA试剂盒和光谱法。

　

        鉴于国内外对三聚氰胺快速现场检测方法的紧急需求，本课题组在成功研发出包括牛奶掺假（干化学试纸联检卡）以及牛奶抗生素残留（胶体金免疫层析）系列产品之后，正抓紧进行三聚氰胺、三聚氰酸胶体金法联检试纸的研制，现该产业项目正在顺利进行中。充分考虑到抗原偶联以及抗体制备或筛选等未确定因素，预计可在十个月至一年的时间内完成产品研制和中试生产。

　

1.2 主要研究内容

　

        以成熟的胶体金免疫层析技术研制三聚氰胺、三聚氰酸双项指标联检试纸。

　

        以首创的干化学试纸联检卡产品形式研制牛奶掺假多项目联检试纸。

　

        现已经完成牛奶掺假多项目联检（亚硝酸盐、硼酸盐、淀粉、双氧水、水杨酸、焦亚硫酸钠和碱等）试纸的研究，正准备小规模批量生产；胶体金法牛奶青霉素残留检测试纸也已顺利完成，可随时进行大规模生产。

　

1.3预期目标

　

        通过联合国内诊断试剂其他生产厂家实现三聚氰胺胶体金免疫层析试纸以及牛奶掺假试纸联检产品的产业化。

　

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二、   三聚氰胺胶体金免疫层析试纸以及牛奶掺假试纸联检技术

　

2.1 干化学法试纸

　

        目前，检验掺假牛乳的方法主要有试剂法、试纸法、乳检管法和仪器法四种。除仪器法基本根据电导原理设计而成外，其余三种方法均是选用对被检物的定性方法，或是把被检物的定量方法简化为快速定性方法。

　

        应用干化学试纸检测掺假牛乳是利用吸附试剂并干燥后的滤纸，与被检液接触而显出的颜色来判定检验结果，它具有携带方便、不需仪器设备、现场快速操作、易于掌握、适于大量样品筛检等特点。

　

        为了满足现场快检的需求，本课题组在前人研制的化学法检测试纸的基础上，稍加改进，首创出针对牛奶掺假的层析式多项联检卡，一次即可完成多项检测。

　

2.2 干化学试纸联检卡

　

        检测试纸条的组装：在一张PVC板上先粘贴30mm*5mm的玻璃纤维素膜（或者聚酯膜），并在其一端放上5mm*5mm处理好的检测滤纸，并用透明胶固定好。

　

        用移液枪吸取一定量的待检测样品滴加到试纸条的加样端，可见样品通过毛细管作用向上移动。5min后，将检测端试纸颜色的变化与阴性样品结果和比色卡对照。

　

　

        最后制得的亚硝酸盐、硼酸盐、淀粉、双氧水、水杨酸、焦亚硫酸钠和碱试纸条的灵敏度分别为0.5mg/100ml、0.5g/100ml、0.1 g/100ml、0.01 g/100ml、0.05 g/100ml、0.1 g/100ml、0.03 g/100ml；该试纸形式的联检卡结果显色快速（5分钟）、易于携带、容易培训，适合于大量筛查的目的。

　

2.3 胶体金法三聚氰胺检测试纸

　

        三聚氰胺的快速现场检测也可以开发出干化学试纸的方法，一般设计为针对三聚氰胺水解产物在试纸上的变色反应。但鉴于化学显色方法在灵敏度和特异性方面有可能存在不足，因此本课题组主要采取了胶体金标记单克隆抗体的免疫层析法进行产品设计。对于三聚氰胺这种小分子的免疫检测要使用胶体金标记抗体的竞争结合法。

　

        选用NC膜作为层析材料，玻璃纤维素膜作样品垫，聚酯膜作为金标蛋白结合垫，吸水纸作为吸收垫，PVC板为支持物，将以上各部分首尾相连，如图1-3所示，并贴上PE标签，即成为成品试纸条，在放有干燥剂的包装袋中密封保存。

　

        分别取30μl的阴性和阳性样品滴加在样品垫上，5~10min后观察现象。如图1-4所示，阴性结果NC膜上出现两条色带，阳性结果NC膜上仅出现一条色带。当质控线即C线不显色时，说明该试纸条已失效。

 

        图1.2为三聚氰胺和三聚氰酸胶体金免疫层析试剂条的结构功能区图，以该技术进行奶品的质量检测的突出优点是：

        ·快速：包括样本处理在内的全部检测过程仅需 3-20分钟。

        ·准确：采用单克隆抗体技术，使产品的灵敏性和特异性都非常好，达到或接近ELISA仪器检测水平。

        ·简便：不需其它任何仪器设备，操作也极其简单，可随时随地在奶站等现场进行。

        ·价格低廉：人员，场地，仪器，管理成本等方面的节省使进行该项检测的整体成本比较低。

        ·人为操作误差小：由于全部操作过程只有“加样”一步，所以操作所带来的误差非常小。

        ·可单人份检测：对标本既能成批检测，又可单份检测，试验者可立刻拿到结果，不必等待。

        ·可进行联检：该层析法为通过硝酸纤维素膜进行横向流动，允许并联多个试剂条进行三聚氰胺、三聚氰酸等多项指标联合检测。

        ·稳定性好：金标试剂稳定，不用冰箱条件，可长期保存（一般为两年）。

        ·样本预处理简单：产品设计和调试合理的话，可将样本预处理环节设计在样品垫工艺中，因而样品预处理简单，适合各种复杂奶品样品的普查。

　

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三、   主要研究内容以及现有研究基础

　

3.1 主要研究内容

　

        本课题组拟利用胶体金免疫层析技术和干化学试纸技术制备出牛奶掺假系列检测试纸作为技术储备。并根据国家食品安全目前局势调整为对三聚氰胺、三聚氰酸两个掺假项目进行产业化为目标的紧急攻关。

　

3.2 主要技术创新点：

　

        胶体金免疫层析的联合检测方式是一些常规仪器检测方法（比如酶联免疫分析）很难实现的：国外曾发表针对猫做的动物实验，三组猫分别喂食三聚氰胺、三聚氰酸、二合一的聚合物。结果，服用聚合物那一组动物全数死亡，但另外两组都没事，显示三聚氰酸三聚氰胺聚合物，要比两种单独存在时更毒。因此，单纯检验三聚氰胺的存在还不足以说明掺假奶品的毒害程度，胶体金免疫层析试纸的联检技术可以实现一次检出乳品中三聚氰胺违禁添加相关的多种物质，我们将产品设计为针对三聚氰胺和三聚氰酸两种掺假物质的联检形式，这样的检测把关更完备。

　

        方便现场即时检验的工艺设计与优化：以往专业检验用途的ELISA方法产品多需要对样品进行预处理，此处理过程需要一定的专业性和配套试剂或仪器要求，不适合现场检测。免疫层析检测技术可适应的检测样品种类更多，并且可以通过样品垫的工艺设计免除预处理操作步骤，只需加入液态奶或水溶解样本一个步骤（“一步法”），即可得到准确的检测结果，可供非专业人士使用，因而非常适合各种场合的大规模筛查或个人的家庭自检。

　

        新发现的牛奶掺假物及其跟进式研发：在成功研发出第一组牛奶掺假物质组合方案（亚硝酸盐、硼酸盐、淀粉、双氧水、水杨酸、焦亚硫酸钠和碱）和青霉素检测项目之后，本课题组将继续进行分组（三聚氰胺及三聚氰酸专项、牛奶掺假系列、牛奶抗生素残留系列等）研究。因为干化学产品及胶体金免疫层析产品具有研发周期短（包括抗原、抗体制备或筛选在内的全部研发时间一般可控制在一年以内）的优势，针对牛奶质量监测方面的新问题也将陆续加入本课题研究中。

　

        胶体金免疫层析试剂盒生产型设备的研制：我课题组已研制成功的连续生产型点膜仪（通用型）是用于胶体金免疫层析检测试剂盒等领域的生产型设备，能连续地把抗体等试剂原料均一地分布在硝酸纤维素膜上，在生产效率上大大地高于实验室用设备，机器配置两套高精度生化泵、相应点膜管线及点膜头（均美国进口），可同时点C、T线，不会划伤膜。该机器的使用只需要引入220CAV/1KVA的电源即可，整机触摸屏操作，全中文提示，操作简单，成功地经过大规模生产型企业的考验，性能非常稳定。

　

        点膜机和切条机是三聚氰胺和三聚氰酸胶体金免疫层析试纸的研发和生产的两种必备的设备，国外设备用于胶体金生产的一般为全自动化连续生产，设备极其昂贵，不适合中国国情，本课题将在已研制成功的通用型点膜机的基础上进一步研发适合中国生产实际需要的多型号连续型点膜机，填补国内食品安全快速检测试纸生产领域设备研发的空白。

　

3.3 胶体金法三聚氰胺检测试纸项目已有基础及优势：

　

3.3.1 胶体金免疫层析快速研发平台的建立

　

        我们已经成熟的掌握了单克隆抗体制备技术并建立了胶体金免疫层析快速研发平台，完善了用于胶体金免疫层析关键原料抗体、抗原原料快速筛选方案。筛选和专门定制了适合国内生产的胶体金免疫层析试剂盒的玻璃纤维膜，聚酯膜，吸水纸，塑料外壳，塑料底板（片材）等耗材。此外，我们具备成熟的抗原蛋白质偶联技术和单克隆抗体制备技术。

　

3.3.2 稳定的胶体金产品研发标准配方工艺

　

        我们组织撰写了研发新产品实验工艺的标准操作规程（SOP），将样品垫、金标垫、硝酸纤维素点膜的配方和工艺优化并固定化以及形成模块化，这些研发思想和操作实践经验的形成和完善将极大地降低新产品研发的诸多不确定性，为胶体金快速研发平台的建立提供了便利条件。可根据国内牛奶行业食品安全监测系统不断提出的新要求快速研发出一系列新产品。

　

3.3.3 已完成的胶体金免疫层析法小分子检测项目

　

※     毒品胶体金免疫层析快速检测项目

　

　

※       食品卫生与安全胶体金免疫层析快速检测项目

　

　

3.3.4 已形成牛奶掺假和抗生素残留检测试纸研究的科学体系

　

        本课题组在前人研制的化学法检测试纸的基础上，稍加改进，首创出针对牛奶掺假的层析式多项联检卡，该法能在5min完成检测，易于操作、适合于现场大量筛检，并且一次即可完成多项检测，可同时测出亚硝酸盐、硼酸盐、淀粉、双氧水、水杨酸、焦亚硫酸钠和碱等非法添加物，该联检卡方法的成功建立可为三聚氰胺干化学试纸方法的研发提供借鉴和经验。

　

        我们通过比较试纸条的不同材料、优化金标蛋白结合和纯化条件、抗原和抗体的包被条件的优化，确定最佳工艺条件，成功地建立了牛奶中青霉素的胶体金免疫层析方法。该法能在5min完成检测，灵敏度可达5ng/ml，且快速、易于操作、适合于现场大量筛检。研发该青霉素快速检测试纸产品我们总共用了约十个月时间。

　

        针对牛奶这一复杂的检测样本，我们还引进了库伦阵列检测器-HPLC，并在青霉素胶体金免疫层析方法检测的研究当中发挥了重要的定量检测对照的作用。

　

        同时，我们还根据国内胶体金生产实际需要自行研制了连续生产型胶体金点膜机。具备进行三聚氰胺胶体金免疫层析试纸中试生产的条件。

　

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四、   三聚氰胺胶体金免疫层析试纸以及牛奶掺假试纸中试生产条件的建立

　

        天津大学生命科学与工程研究院（以下简称“研究院”）成立于1998年，天津大学投资一千万元进行建设，生物工程是其重点建设的学科。2004年3月29日， 天津大学-派坤生物联合实验室成立。实验室以天津大学生命科学与工程研究院研究院为依托，以天津大学即时检验中心为主体，联合化工学院、精仪学院等相关学科，建成了一个具有国际水平、国内生物产业示范、兼有“体外诊断试剂（简称'IVD'）新产品研发”和“专业人才培养和教学”两大功能的产业合作实验室。

　

         作为国内第一家专门从事即时检验（POCT）技术研究和专一服务于国内外IVD行业的大学研究机构。研究院翻译和整理了大量的派坤生物美国技术研究与生产合作中心（MRC）的技术资料，培养了国内众多的胶体金专业人才，并组织天津大学的师资力量及中美IVD行业内专家共同撰写了国内第一部胶体金类IVD新产品小试、中试、生产工艺标准操作规程（SOP）和全质量体系文件。

　

        我们按照国家对胶体金类检测试剂的管理规范，以GMP级别的操作规程进行产品的研制和生产。

 

       

　

        现在本课题组已经在天津大学北洋科学楼四层建立了符合GMP标准的胶体金免疫层析快检行业中试示范实验基地。胶体金免疫层析金标室、点膜室、粘膜室、配液室、切割室、组装室、装配室、真空干燥装置、烘箱；各种基因工程全自动发酵罐及动植物细胞培养装置、各种分离纯化及高效液相色谱、电化学库仑阵列检测器等分析检测设备一应俱全。

　

       目前该项目已经按照诊断试剂国家研发、生产及质量检验标准顺利完成产业化进程，除了产业合作之外，同样欢迎检验机构或经销单位与我们洽谈采购以及委托检验等事宜， 我们愿集成相关行业整体优势尽快实现该项目的普及化。

　

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